2019年12月05日國家藥品監督管理局醫療器械技術(shù)審評中心發(fā)布最新一版《腫瘤相關(guān)突變基因檢測試劑（高通量測序法）性能評價(jià)通用注冊技術(shù)審查指導原則(2019年第83號)》  （以下簡(jiǎn)稱(chēng)“指導原則”），該指導原則是針對腫瘤相關(guān)基因檢測試劑分析性能評價(jià)的一般要求，性能評價(jià)主要思路是：提出產(chǎn)品性能有效性、安全性相關(guān)問(wèn)題的假設，然后通過(guò)研究進(jìn)行確認。

參考品作為性能評價(jià)的主要原材料，可謂是非常重要，文中對此做了詳細的要求，今天我們就參考品做一些討論。

原文：
4. 參考品要求
內部參考品是保證產(chǎn)品性能穩定性以及檢測值可溯源的重要構成之一。參考品研究應包括原料選擇、制備過(guò)程、定值研究及評價(jià)指標等。申請人應對內部陽(yáng)性/陰性參考品的來(lái)源、基因序列設置等信息進(jìn)行驗證，并提供參考品溯源過(guò)程的測量程序或參考方法的相關(guān)信息及詳細的驗證資料。

具體要求如下：
4.1陽(yáng)性參考品及陽(yáng)性質(zhì)控品：
4.1.1陽(yáng)性參考品
理想狀態(tài)下，陽(yáng)性參考品應當包括對所申報產(chǎn)品每個(gè)基因型的質(zhì)控樣本。但考慮到基于NGS技術(shù)的可檢測基因數量較多，申請人應結合產(chǎn)品預期用途、臨床意義及基因類(lèi)型等因素進(jìn)行針對性和代表性的設計。
對于有明確腫瘤伴隨診斷相關(guān)的基因，應考慮該類(lèi)基因參考品設置的合理性和完整性，需包括伴隨診斷相關(guān)的全部熱點(diǎn)基因，建議采用臨床樣本或細胞系提取的核酸儲備液作為原料。
對于具有顯著(zhù)臨床意義或潛在臨床意義的基因，應考慮代表性問(wèn)題，明確具有臨床診斷意義的基因類(lèi)型及基因型中不同的變異類(lèi)型。突變頻率、變異類(lèi)型的選取應具有代表性，包括不同外顯子，不同基因變異突變等。

如檢測編碼區較大且存在非熱點(diǎn)區域設計（如大于1M），建議在陽(yáng)性參考品中考慮對檢測整體區域的靈敏度驗證（主要關(guān)注SNV等），如混合的永生化正常人白細胞DNA儲存液等。
不同突變/變異的變異豐度及突變頻率，濃度范圍設置應具有代表性并提供這樣設定的依據。陽(yáng)性參考品的突變形式及拷貝數需采用有效方法進(jìn)行確認，并明確接受標準。申請人在設計陽(yáng)性參考品時(shí)可一并考慮檢測限參考品的設置及確認方式，并提供相關(guān)的依據。
4.1.2陽(yáng)性質(zhì)控品
模擬病人樣本的目標核酸序列，并用于質(zhì)控整個(gè)檢測過(guò)程，包括核酸提取（如適用）、文庫構建、測序和數據分析。目前陽(yáng)性質(zhì)控檢測和分析過(guò)程應與臨床樣本方式一致。
4.2陰性參考品及陰性質(zhì)控品
陰性參考品及陰性質(zhì)控品建議為正常臨床樣本的混合物或細胞系，應明確不含有目標區域腫瘤突變基因。
4.3精密度參考品
精密度參考品設置要求可參考陽(yáng)性/陰性參考品。
4.4 PCR 試劑無(wú)模板質(zhì)控品（No Template Control，NTC）（如適用）
申請人應根據申報產(chǎn)品特點(diǎn)設置NTC質(zhì)控品及檢測接受標準，監測檢測過(guò)程中是否存在污染。

從原文中可以看出：
1.參考品是必須要的；
2.陽(yáng)性參考品設置最為復雜，著(zhù)重聚焦臨床意義的基因位點(diǎn)，不要求全覆蓋，同時(shí)要考慮靈敏度（最低檢出限LoD）設置，考慮到濃度梯度或突變梯度的不同，應對各水平陽(yáng)性參考品設置相應檢出要求；
3.陽(yáng)性質(zhì)控品應該匹配整個(gè)檢測過(guò)程，檢測和分析應該與臨床樣本一致，用于陽(yáng)性、陰性的判斷；
4.陰性參考品和陰性質(zhì)控品可以為正常臨床樣本或者細胞系，可以?xún)烧哂猛粋€(gè)；
5.精密度參考品主要用于使用相同的樣本（包括檢測臨界值附近的樣本）在各種特定條件下進(jìn)行檢測（如不同操作員，不同操作條件，不同檢測天數，不同儀器等），并考慮檢測中主要的變異來(lái)源，通過(guò)重復性檢測來(lái)評價(jià)性能；
6.NTC主要是用于分析特異性，評估產(chǎn)品僅可檢測到預期待測變異的能力。

綜上所述，對于參考品的設計，我們可以得出如下的表格（本設計僅代表小編個(gè)人意見(jiàn)）
 

按照這個(gè)思路，我們一步一步來(lái)設計一個(gè)完整的panel。
首先第一步是選擇基因位點(diǎn)，可以按照如下原則來(lái)設計：
1.如果是一個(gè)小panel，一般設計都是針對某一癌種，對應的基因都是比較明確，位點(diǎn)能明確的盡量明確，不能明確的盡量涉及多種類(lèi)型，比如SNV、Insertion、Deletion、Fusion、CNV，更細分的話(huà)，還有frameshift_variant、inframe_deletion、inframe_insertion、missense_variant、Splice_acceptor_Variant、Splice_Donor_Variant、Synonmymous_Variant等等。
因此對應的參考品要求覆蓋全基因，位點(diǎn)也盡量全覆蓋，參考品信息可以在科佰生物官網(wǎng)查詢(xún)www.dralberteburke.com，如果沒(méi)有的位點(diǎn)，可以聯(lián)系科佰生物定制位點(diǎn)。
 

2.如果是一個(gè)大panel，對于參考品、檢測限、精密度，一般是不可能做到所有基因全覆蓋，并且固定的%AF和CN值的，因此按照《指導原則》的要求，我們應該選擇具有臨床意義的基因和位點(diǎn)來(lái)表征，首當其沖的就是NCCN指南提及的基因，另外再加一些臨床藥物研發(fā)的靶點(diǎn)和biomarker。其中需要特別注意的是由于NGS的探針原理，不能很好的分析出每一種fusion的斷點(diǎn)信息（DNA層面，內含子斷點(diǎn)不唯一），因此建議大Panel選擇RNA作為fusion的檢測對象，同樣的也需要選擇RNA作為參考品。

對于大panel的陽(yáng)性質(zhì)控品選擇，可以選擇泛腫瘤的質(zhì)控品：
 

如下列舉了常見(jiàn)的重要的基因位點(diǎn)信息，供大家參考，panel的參考品盤(pán)可以從中選取：
 

（部分截圖）

完整表單請點(diǎn)擊下載

有了選取的基因和位點(diǎn)，我們開(kāi)始依次設計參考品、質(zhì)控品、檢測限和精密度，
1.陽(yáng)性參考品盤(pán)

1.1根據目的選擇全盤(pán)的基因和位點(diǎn)，比如按照癌種設計；
1.2盡量覆蓋所有的基因和位點(diǎn)；
1.3盡量覆蓋SNV、indel、fusion和CNV；
1.4盡量多種突變細分類(lèi)型，尤其可以考慮一些內含子的剪切變異；
1.5Fusion可以選擇DNA和RNA；
1.6多個(gè)位點(diǎn)要拆包設計，不能把臨近甚至相同位點(diǎn)放在一個(gè)包里面；
1.7設計的每個(gè)包突變頻率或者CN值固定，這樣利于直接轉變?yōu)闄z測限標準品；
1.8不同包之間，盡量互補；
1.9一定要關(guān)注內源突變的影響；
1.10如果能兼顧精密度、質(zhì)控盤(pán)的設計是最好的，這樣能一個(gè)包多種用途。
 

參考品盤(pán)設計好之后，就是實(shí)際落地去定制，這其中又涉及倍性、拷貝數的計算，還有最終檢測的QC標準，一般是選擇DdPCR定標，這些工作可以交給科佰生物，我們可以按照客戶(hù)的要求定制符合標準的參考盤(pán)混合標準品。
 

同時(shí)科佰生物也推出了幾款現貨參考品盤(pán)，感興趣的朋友可以點(diǎn)擊表格查看：

 推薦陽(yáng)性參考品盤(pán)：

2.檢測限參考品
檢測限參考品的設計比較簡(jiǎn)單，只要將前面定制的參考品盤(pán)稀釋到待測的檢測限即可，至于下降到什么標準，依據平臺、待測樣本等因素而定，一般靈敏度是早篩>液體活檢>組織檢測。
 

3.精密度參考品
精密度參考品一般是用于看體系的重復性，因此取決于實(shí)驗室各項的變數多不多，對于單批次的參考品需要在不同條件下測試，同時(shí)不同批次的參考品也需要在不同條件下測試，尤其是LoD附近的檢測重復性。
因此如果能做到完全把參考品的全部包都能充分驗證精密度是最佳的，但是這樣的話(huà)確實(shí)成本、周期都比較長(cháng)，折中的選擇是盡量選擇全部的基因，位點(diǎn)可以是一部分，選擇一個(gè)適中的突變頻率或者CN值，再選擇一個(gè)LoD附近的突變頻率或者CN值（當然一般建立體系時(shí)還未知LoD的范圍，因此這個(gè)可以后期測試），來(lái)做精密度的性能評價(jià)。
 

4.陽(yáng)性質(zhì)控品盤(pán)
陽(yáng)性質(zhì)控品盤(pán)應該匹配整個(gè)檢測過(guò)程，檢測和分析應該與臨床樣本一致，用于陽(yáng)性、陰性的判斷。
4.1可以選擇細胞沉淀、石蠟塊這樣的樣品形式，包含提取的過(guò)程；
4.2陽(yáng)性質(zhì)控品使用頻率高，可以批量制備；
4.3陽(yáng)性質(zhì)控品用于陽(yáng)性判斷，因此只要包含所有的基因，不用所有的位點(diǎn)；
4.4陽(yáng)性質(zhì)控品用于陽(yáng)性判斷，出于容易檢出的目的，可以設計高一些的突變頻率和CN值。
 

科佰生物推出一款現貨陽(yáng)性質(zhì)控品盤(pán)，包含基因多，突變種類(lèi)齊全，可以點(diǎn)擊表格查看。

  推薦陽(yáng)性質(zhì)控品盤(pán)：

針對大panel的陽(yáng)性質(zhì)控品，可以考慮泛腫瘤大panel參考品。

5.陰性參考品
陰性參考品建議為正常組織或者細胞系，只要明確不含有目標區域腫瘤突變基因即可。這里需要提醒的有四點(diǎn)：
5.1陰性參考品用量比較大；
5.2陰性參考品選擇容易制備，而且穩定的樣品，穩定是指穩定供應、基因組穩定；
5.3陰性參考品的突變驗證盡量選擇深度高的NGS或者DdPCR；
5.4陰性參考品還要測對應基因的CN值和倍性；

推薦陰性參考品：

 6.陰性質(zhì)控品
參照5. 陰性參考品
推薦陰性質(zhì)控品：

現在分子診斷技術(shù)日新月異，傳統的PCR、Q-PCR、AMRS-PCR、FISH，一直都被大量用于臨床診斷，到現在如日中天的NGS，越來(lái)越得到大家的認可，再到下一代的三代測序，讀長(cháng)長(cháng)，周期短，便攜，未來(lái)預期美好。技術(shù)的革新給患者帶來(lái)新的希望，質(zhì)量保障是希望的前提，參考品盤(pán)是質(zhì)量檢測有力的工具。

我們呼吁業(yè)內的每一家單位的每一個(gè)檢測，都能用上參考品，對我們每一份發(fā)出的數據都能負責。