質粒隨機整合穩(wěn)定細胞株
▏ 定義
質粒轉染是一種將質粒DNA導入細胞的技術,使科學家能夠研究基因功能、表達和細胞效應。它涉及使用非病毒方法將外來DNA導入細胞,例如電穿孔或化學試劑。
如下我們重點介紹化學試劑介導下的質粒轉染,電穿孔另開主題介紹。
▏ 基本原理
我們經常使用的轉染化學試劑有Lipofectamine/CaPO4/FuGene/PEI等,原理基本是相同的: 1. 在體外混合質粒和轉染試劑,質粒DNA帶負電荷,轉染試劑帶正電荷,由轉染試劑包裹質粒DNA在體外形成穩(wěn)定的復合物; 2. 外圍帶正電荷的復合物,接觸到帶負電荷的細胞膜,穿透細胞膜,形成Endosome(一種真核細胞內的膜結合細胞器,屬于囊泡結構,是細胞內吞作用中物質運輸?shù)年P鍵環(huán)節(jié)); 3. 在細胞質內釋放外源的質粒DNA,DNA通過核孔進入細胞核,參與外源基因的表達。
▏ 瞬時表達和穩(wěn)定整合表達
常見質粒轉染,沒有定點的、特殊的整合機制,因此當質粒被遞送到細胞核中,整合是隨機發(fā)生的,而且只有一小部分質粒會隨著細胞DNA復制過程中的斷裂,經過修復機制的作用,被整合到宿主的染色體基因組中。 因此我們總結幾個重要的特點: 1. 隨機整合,整合效率低,不一定會整合到轉錄活躍區(qū); 2. 大量未整合的質粒(以1x10e6轉染5 μg為例,以pcDNA3.1載體加上3000bp的目的基因為例,大約是5.37*10e11 copies),隨著細胞分裂慢慢被稀釋或降解; 3. 一般24-96小時會形成一個瞬時表達的最高峰; 4. 被整合的拷貝需要經過抗性(antibiotic)篩選得到陽性細胞,并且后期需要抗性維持壓力; 5. 因為是通過DNA斷裂修復重組進去的,所以后期也存在這個位置再次斷裂的可能性,進而破壞了目的基因,因此可以說穩(wěn)定性是個挑戰(zhàn),建議做單克隆穩(wěn)定細胞株,做傳代穩(wěn)定性分析; 6. 線性DNA比環(huán)狀DNA整合得更有效率,但是線性DNA比環(huán)狀DNA更難遞送; 7. 不同細胞類型差異較大,表現(xiàn)在“遞送差異”和“整合差異”上; 8. 遞送的化學試劑,多少存在毒性,需要平衡遞送效率和毒性; 9. 被遞送的質粒要去內毒素,內毒素會引起免疫反應。
▏ 應用場景
1 瞬時轉染,追求瞬間高拷貝/超拷貝的蛋白表達 2 穩(wěn)定細胞株構建,生物安全等級低,對整和效率、整合位置要求不高
▏ 穩(wěn)定細胞株構建服務
科佰生物提供“質粒隨機整合系統(tǒng)”穩(wěn)定細胞株構建服務,利用該系統(tǒng),我們已經成功構建超過500株穩(wěn)定細胞株的模型,有著豐富的經驗,歡迎溝通咨詢。 質粒轉染 病毒感染 Flp-FRT系統(tǒng) 轉座子系統(tǒng) 基因編輯 脂質體 電轉 慢病毒 適用細胞 部分細胞 幾乎所有細胞 幾乎所有細胞 內部4種細胞 幾乎所有細胞 部分細胞 轉染/感染效率 低 中 高 高 高 低 隨機整合 是 是 是 否 - 否 生物安全等級 BL1 BL1 BL2 BL1 BL1 BL1 基因裝載能力 - - <4-5k - - - 陽性率 低 高 高 高 高 低 周期 基因合成 2-3周 2-3周 2-3周 2-3周 2-3周 2-3周 病毒包裝 - - 1周 - - - 混合克隆篩選 1-2周 1-2周 1-2周 1-2周 1-2周 1-2周 單克隆篩選 >3 周 >3 周 >3 周 可選 可選 >3 周 合計 > 8-10 周 > 8-10 周 >9-11周 5-7 周 5-7 周 > 8-10 周 工作負荷 高 中 中 低 低 高