2019-nCov作為一種新型冠狀病毒，是一類(lèi)具有囊膜、基因組為線(xiàn)性單股正鏈的RNA病毒，該病毒采集自不同地區患者的病毒樣本相關(guān)序列也已發(fā)布至2019新型冠狀病毒信息庫（https://bigd.big.ac.cn/ncov）。NCBI收錄序列為NC_045512.2，全長(cháng)29903bp，基因編碼4個(gè)結構蛋白：S，M，N和E。

為了滿(mǎn)足臨床診斷的需要，截止目前，國家已經(jīng)緊急批準了幾款核酸診斷試劑盒上市，用于臨床診斷，其中多數都是采用RT-PCR的方法，多日的臨床檢測結果顯示，該診斷存在高比例的假陰性問(wèn)題，往往需要多次的檢測，才能被最終驗證，同時(shí)科技部也是應急征集除普通實(shí)時(shí)定量熒光PCR外快速診斷產(chǎn)品，理論上ddPCR、NGS、三代測序都能更好的檢測病毒，同時(shí)監控病毒的變異。

不管是哪一類(lèi)產(chǎn)品，試劑盒的檢測限問(wèn)題，是造成假陰性的最大根源，因此針對診斷產(chǎn)品的檢測限，我們需要認真做每款試劑盒的性能評價(jià)。以往針對檢測限的性能評價(jià)，一般是選擇體外轉錄的RNA、或者臨床陽(yáng)性病毒來(lái)作為標準品，用于性能評價(jià)。但是兩者都具有很明顯的確定，首先體外轉錄的RNA，一般是很純，單一，不涉及提取，不符合臨床病毒的微環(huán)境，因此必然造成檢測靈敏度被高估，這也是存在高概率假陰性的主要原因；再次臨床陽(yáng)性病毒，即使是滅活的病毒，也是存在很大的生物安全隱患，因此要求實(shí)驗室級別為P3-P4，大部分開(kāi)發(fā)診斷試劑盒單位都不滿(mǎn)足改要求，另外臨床陽(yáng)性病毒也是來(lái)源很有限，不能被穩定供應，反復用于試劑盒的性能評價(jià)。

有病毒的完整包膜結構，有2019-nCov對應的核酸序列，但是生物安全風(fēng)險較低的假病毒標準品，完美的克服了選擇體外轉錄的RNA、或者臨床陽(yáng)性病毒來(lái)作為標準品的缺點(diǎn)，非常適合用于核酸診斷新型冠狀病毒2019-nCov。

構建過(guò)程：2019-nCov基因合成→假病毒包裝→純化→QC檢測（ddPCR）

ORF1ab/RdRP（2995bp)、Gene N (1260bp)

• 根據新型冠狀病毒的特點(diǎn)，選取了ORF1ab/RdRP（RNA-dependent RNA polymerase）、Gene E(envelope protein)、Gene N(nucleocapsid phosphoprotein)合計3個(gè)區段的序列，用于假病毒的包裝，3個(gè)區段很好的表征了2019-nCov的特征序列；

• 科佰生物設計了ddPCR體系的引物、探針序列，可不需要構建標準曲線(xiàn)的前提下完成對假病毒的QC拷貝數檢測，非常準確表征標準品的拷貝數，而且克服了Q-PCR分析CT值的相對判斷標準的不準確性；

• 假病毒標準品，無(wú)致病性，可再生，質(zhì)控方法可靠，批次間穩定，可以長(cháng)期穩定制備和供應，而且要求實(shí)驗室生物安全級別為P2，滿(mǎn)足很多單位的安全需求。

ORF1ab/RdRP:

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